蛋白質(zhì)純化方法及原理（蛋白質(zhì)純化的基本步驟及原則）
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添加時(shí)間：2022-10-15 瀏覽次數(shù):7967
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蛋白純化技術(shù)是生物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。要研究某一個(gè)特殊蛋白質(zhì)，首先就要將這個(gè)蛋白從生物體中分離純化出來(lái)。蛋白純化方法主要是利用不同蛋白質(zhì)間的相似性與差異，依據(jù)蛋白間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的差異性將目的蛋白分離出來(lái)。在本文中，我們將介紹2種常用的蛋白純化的方法。
1、自制的簡(jiǎn)易柱子，直徑約為1cm，長(zhǎng)度約為2cm，在柱子的下端加入蒸餾水，并關(guān)閉柱子的出口。
2、將瓊脂糖凝膠倒入柱子，讓填料自然沉降，依次用二到五倍的柱子體積的無(wú)菌水、8mol/L的尿素、無(wú)菌水洗柱子。
3、緩慢加入5ml的硫酸鎳，至柱子的顏色由白色變?yōu)樗{(lán)色，待藍(lán)綠色收集液體滴下來(lái)為止。
4、用二到五倍體積的PBS緩沖液平衡柱子，再將粗蛋白樣品進(jìn)行上樣，用梯度濃度50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L、250mmol/L咪唑進(jìn)行過(guò)柱，流速約為1ml/min。
5、以每個(gè)濃度用1.5ml的Eppendorf收集八管，再用二到五倍體積的無(wú)菌水洗柱子，再用二到五倍的50mmol/L的EDTA洗柱子，除去NiSO4，待至無(wú)色狀態(tài)
6、用多倍體積的無(wú)菌水進(jìn)行洗柱子，將手機(jī)液10%的分離膠進(jìn)行SDS—PAGE分析。
離子交換層析
1、將macro prep High-Q強(qiáng)陰離子交換填料混勻，吸取16 ml于小燒杯中，靜置待填料沉降至燒杯底部，吸取并棄去上清。
2、在燒杯中加入4倍體積的ddH2O，混勻，靜置，沉降后去上清。重復(fù)2次以充分洗去保存填料中的乙醇。
3、在空柱中加入柱體積10%的裝柱緩沖液，靜置除去可能存在于柱壁和柱底部薄膜上的氣泡。
4、以1:1（v/v）比例在燒杯中加入裝柱緩沖液（20 mM sodium phosphate,pH 7.0,1 M NaCl），混勻。用玻璃棒引流加入至柱中，并用裝柱緩沖液填滿剩余柱體積。靜置30 min。
5、待填料均沉降至柱底部后，將適配器以較小的傾斜角度插入至柱中填料頂部。
（1）打開(kāi)柱低端開(kāi)口，以最大流速10 ml/min泵入裝柱緩沖液，壓實(shí)填料。
（2）緩慢降低緩沖液的流速，并將裝柱緩沖液更換成結(jié)合緩沖液（20 mM sodium phosphate,pH 7.0）。
（3）設(shè)定蛋白純化程序，使用15倍柱體積緩沖液線性梯度洗脫目的蛋白。
（4）收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
（注意：所有層析所需的溶液以及蛋白樣品都需要使用0.22μm的濾膜過(guò)濾，少量的溶液或蛋白樣品需要可使用針頭濾器，大量的溶液需要使用506的溶劑過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。）
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